EML4-ALK 融合基因（gene fusion）是继 EGFR 基因突变后非小细胞肺癌（NSCLC）的又一重要驱动基因。EML4 基因可在多个位点发生断裂，与位于 ALK 第 20 外显子的胞内催化域相连，形成 EML4-ALK 融合基因。EML4 断裂位点不同可以与 ALK 形成至少 10 种以上的 EML4-ALK 融合基因变体（Variant），其中，变体 1 和变体 3 最常见。
ALK 融合基因检测目前存在 FISH（检测 ALK 扩增）、RT-PCR（检测 ALK 变体类型）和 Ventana IHC（检测 ALK 蛋白表达）等三种主要检测手段，三个方法高度一致。
目前，针对 ALK 融合基因的靶向治疗药物克唑替尼，尽管在 ALK 阳性患者获得良好的无进展生存和客观有效率，最终还是难逃耐药而治疗失败的命运。
其耐药机制主要是 ALK 蛋白激酶结构域二次突变，常见的有 8 种（图 1）：L1196M 是守门员突变，机制类似 EGFR 的 T790M 突变，而 G1202R 对多数 ALK 抑制剂不敏感。
图 1 克唑替尼耐药突变
其它耐药机制为 EGFR 激活、ALK 扩增、SRC 激活和 cKit 扩增等。EML4-ALK 基因全长达到 4860 个碱基，编码 1620 个氨基酸，可能发生的二次突变远不止这 8 种，临床研究中陆续发现了其它二次突变，比如：F1174C、D1203N、I1171T 等。一个 ALK 阳性 NSCLC 患者体内还可能有一种以上 ALK 突变 。
ALK 二次突变的演化规律
1. 色瑞替尼（Ceritinib）
Gainor 等对一项色瑞替尼临床试验（NCT01283516）中的 23 例 ALK 阳性患者进行克唑替尼治疗后/色瑞替尼治疗前的再活检，用 FISH 方法在 19 例中发现了原发的 ALK 融合持续存在，在 2 例中发现了 ALK 扩增。用直接测序法发现了克唑替尼耐药突变（C1156Y，L1196M，S1206Y，G1269M，1151T）的 7 例患者色瑞替尼对均有效，其中 1151T 突变的患者 PFS 为 2.7 月（可能与色瑞替尼对 1151T 的 IC50 较高有关）。
克唑替尼和色瑞替尼对存在或不存在 ALK 二次突变的二类患者的 PFS 并未发现显著统计学差异。
Gainor 等另外对 11 例色瑞替尼耐药患者进行了基因检测（表 1）。
表 1 色瑞替尼耐药后的基因检测结果
对第 4，5，8 号患者进行了 FISH 检测，MET、HER2 和 EGFR 均为阴性。
2. 艾乐替尼（Alectinib）
艾乐替尼的耐药突变为 G1202R、I1171N/S、R1209Q、V1180L 等。
Oscar Puig 等用二代测序法（NGS）对艾乐替尼的二个临床试验 NP28673 和 NP28761 里的 ALK 阳性 NSCLC 患者进行了组织和外周血的基因检测（表 2）。
表 2 样品取样比例
在 12 例克唑替尼耐药患者身上发现了 13 种 ALK 耐药突变（F1174C，L1196M，S1157F，R1231W，G1128A，V476A，I1171T，G1269A，C1156F，S1206Y，F1245C，A416P），其中 5 种突变为以前文献未见。
携带 F1174C，L1196M，S1157F，R1231W，G1128A，G1269A，C1156F 突变的患者经艾乐替尼治疗 PFS 超过 3 个月以上，携带 S1157F 突变的患者稳定 15.4 个月，携带 S1206Y+F1245C 双突变的患者对艾乐替尼无效。对 4 例艾乐替尼耐药后 ALK 突变情况进行了检测（表 3）。
表 3 艾乐替尼耐药后的基因检测结果
另外，Oscar Puig 对 45 例仍在服用艾乐替尼的患者进行了外周血中 ALK 等位基因丰度的变化趋势，对艾乐替尼敏感的几种 Alk 突变（F1174V/L，S1157F，T1151R，S1206F，I1268V，G1269A，C1156C/F 等）呈下降趋势，而对艾乐替尼耐药的几种 Alk 突变（G1202R、I1171N/S、R1209Q、V1180L）呈上升趋势（图 2）。
图 2 外周血中 ALK 等位基因丰度的变化趋势
在 2 例患者中还发现了多种 ALK 突变共存现象，1 例携带 T1151M 的患者，服用艾乐替尼期间出现了 G1202R 和 I1171N/S 三种突变，而 T1151M 突变消失了。另一例携带 I1171T 和 F1174V 的患者，服用艾乐替尼期间新增了 R1209Q 突变，而 I1171T 和 F1174V 的等位基因丰度不断降低中。
3. Brigatinib（AP26113）
Scott N.gettinger 等使用二代测序法（NGS）对 Brigatinib 的 36 例临床试验患者的肿瘤组织进行了基因检测，其中 32 例检测了入组前的组织，4 例检测了 Brigatinib 耐药后的肿瘤组织。携带 ALK 突变的患者的 ORR 高于不携带的患者（表 4）。
表 4 入组前携带 ALK 突变的患者
表 5 Brigatinib 耐药后的基因检测结果
*该例患者从 180 mg 每天加量至 240 mg 每天后，继续服用 Brigatinib 中。
4. Ensartinib（X-396）
2016 年 ASCO 会议报道了 Ensartinib II 期临床部分数据，剂量 ≥ 200 mg 每天一次的 ALK 阳性非小细胞肺癌 38 例，其中克唑替尼未治 8 例，克唑替尼耐药 20 例，克唑替尼和色瑞替尼耐药 7 例，克唑替尼、色瑞替尼和艾乐替尼耐药 2 例，克唑替尼、色瑞替尼和 Brigatinib 耐药 1 例。
使用二代测序 NGS 检测患者中组织和血液的 ALK 突变基因。
克唑替尼耐药的患者可评价的人数为 13 例，85% 的患者仍为 ALK 阳性，3 例携带 ALK 二次突变， T1151M 1 例 PFS 为 4 个月，L1196M 1 例 PFS 为 5 个月，该 2 例患者 Ensartinib 耐药后基因数据缺失；一名携带 G1269A 的患者 PFS 为 13 个月，Ensartinib 耐药后携带 L1196M+G1269A 突变。无效的 1 例为 QSLP1188P+R1133Q+S1206F 突变，肺部有效，脑部进展。
克唑替尼和色瑞替尼耐药的患者总有效率为 29%，1 例 PFS ＞ 9 个月，另一例有 G1202R+HER2 突变，PFS5 个月，进展后发现 G1202R+V1149M 突变，G1202R 丰度从 0.7% 增加到 1.7%；进展患者中有 1 名患者肺部完全缓解，脑部进展，另 1 例患者为 G1202R 突变（丰度 0.5%）。
5. Lorlatinib（PF-06463922）
Lorlatinib 刚开始 2 期临床，其耐药信息不足，目前仅报道 1 例 C1156Y+L1198F 双突变的耐药患者，重回克唑替尼有效。
总结和讨论
表 6.ALK 融合基因阳性和二次突变情况
1. LK 阳性患者在克唑替尼耐药后，及经艾乐替尼、色瑞替尼、Brigatinib 或 Ensartinib 序贯治疗后，绝大多数患者仍为 ALK 阳性。
2. 在多种 ALK 抑制剂序贯治疗后，ALK 二次突变在耐药患者中所占比例大大增加，而种类大大减少。
3. 克唑替尼耐药患者经 2 代或 3 代 ALK 抑制剂治疗后，出现了双突变，甚至三突变。比如 Brigatinib 对 E1210K、D1203N、G1269A 等单独突变均有效，复合突变后无效。对于这类多重耐药突变的机理仍需要进一步研究。
4. 虽然 Brigatinib、Ensartinib 和 Lorlatinib 在临床试验里显示了对 G1202R 的有效性，但 G1202R 突变在除 Lorlatinib 外的 ALK 抑制剂耐药患者中均有存在。
5. 外周血中的 ALK 等位基因丰度变化趋势可以辅助评估治疗效果。目前亟需准确可靠的二代测序服务，为 ALK 阳性患者用药起指导作用。
